Mikroflora pyłku roślin wiatropylnych

Radosław Śpiewak, Zofia Prażmo, Ewa Krysińska-Traczyk, Jacek Dutkiewicz

Zakład Aerobiologii i Alergologii, Instytut Medycyny Wsi w Lublinie

Materiał i metody

Ogółem analizie poddano dziesięć próbek pyłków czterech roślin wiatropylnych o silnym działaniu alergennym: żyta (Secale cereale), bylicy (Artemisia vulgaris), olchy (Alnus glutinosa), leszczyny (Corylus avellana) i brzozy (Betula verrucosa). Badania przeprowadzono na próbkach pyłków zebranych w latach 1994 - 1997. Szczegóły dotyczące czasu i miejsca zbioru próbek zostały przedstawione w tabeli 1. Próbki zbierano poprzez zerwanie kwiatostanów roślin wiatropylnych bezpośrednio przed rozpoczęciem pylenia.

Kwiatostany (ew. łodygi z kwiatostanami) umieszczano następnie w wazonach w pomieszczeniu laboratoryjnym, na podłożu wyłożonym jałową folią. Po rozpoczęciu pylenia, pyłek osiadał na folii, skąd zbierany był do jałowych pojemników. Następnie próbki pyłku zawieszano w jałowym, 0,9% wodnym roztworze chlorku sodu w stosunku wagowym 100 mg pyłku na 10 ml roztworu NaCl. Następnie wykonywano szereg rozcieńczeń 10^-2, 10^-3, 10^-4, które posiewano na agar z krwią, agar EMB, agar z trypsyną i soją (agar TS), na agar z brzeczką (Difco Malt Agar). Wyniki oznaczeń wyrażono podając liczbę cfu (colony forming units) na jeden gram pyłku.

Wyniki

Tabela 2 przedstawia wyniki posiewu badanych pyłków roślin wiatropylnych na agarze z krwią. Agar z krwią jest podłożem nieselektywnym, umożliwiającym wzrost bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym (a także grzybom i drożdżakom). Jak wynika z danych zestawionych w tabeli 2, na pyłkach można było stwierdzić obecność zarówno bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych. Stężenie bakterii Gram-dodatnich wahało się w zakresie od 0 cfu/g do 21000 cfu/g, zaś bakterii Gram-ujemnych od 0 cfu/g do 30000 cfu/g. Wyniki posiewu 10 badanych próbek pyłków roślin wiatropylnych na podłożu EMB przedstawia tabela 3. Podłoże EMB jest pożywką wybiórczą dla bakterii Gram-ujemnych. Na podstawie posiewów na wybiórczym podłożu EMB, stężenie bakterii Gram-ujemnych określono na 0-33000, było ono zatem porównywalne z wynikami uzyskanymi w posiewach na agarze z krwią.

Wyniki posiewu czterech, przebadanych na obecność termofilnych promieniowców, próbek pyłków roślin wiatropylnych na agarze TS przedstawia tabela 4. Jak z niej wynika, zawartość promieniowców w próbkach pyłku wahała się między 0 cfu/g a maksymalnie 10000 cfu/g. Promieniowcem najczęściej występującym na pyłkach był Thermoactinomyces thalpophilus. Stwierdzano ponadto obecność promieniowca Thermoactinomyces vulgaris, oraz gatunków z rodzaju Streptomyces.

Wyniki mikologicznego badania próbek przedstawia tabela 5. Jak z niej wynika, wartość stężenia poszczególnych gatunków grzybów w próbkach pyłków mieściła się w przedziale od 0 do 34000 cfu/g. Wykazano obecność gatunków Alternaria alternata, Oidiodendron flavum, Cephalosporium charticola, obecne były również gatunki z rodzaju Penicillium oraz drożdże.

Omówienie wyników

Obserwacja, iż z pyłków roślin wiatropylnych wyhodować można różnorodne bakterie pozostaje w zgodzie z wcześniejszymi doniesieniami (Colldahl i Carlsson 1968, Colldahl i Nilsson 1973). Nie można wykluczyć, że do zakażenia pyłku dochodzi w wyniku jego interakcji z innymi bioaerozolami w powietrzu, gdyż jak wiadomo (Gregory 1973, Cox i Wathes 1995), mikroflora powietrza jest bardzo zróżnicowana i bogata. W wyniku takich procesów pyłek może zmieniać swoje właściwości, co powoduje różnice międzyregionalne pyłku nawet roślin jednego i tego samego gatunku (Schäppi, w druku). Jednakże w przypadku prezentowanych badań analizowano próbki pobrane bezpośrednio z roślin, a zatem takie, które (poza procedurą zbierania) nie miały okazji wejść w kontakt z mikroflorą powietrza. Ponieważ mało prawdopodobne jest zakażenie pyłku przed opuszczeniem pylnika, można spekulować, że do zakażenia doszło w momencie pylenia, a źródłem mikroorganizmów jest powierzchnia rośliny. Ostateczna odpowiedź na tę kwestię wymagałaby jednak dodatkowych badań. Otwarte pozostaje również pytanie, czy obecność tych mikroorganizmów na ziarnie pyłku ma wpływ na proces zapylania.

Interesujące są implikacje faktu obecności bakterii i grzybów na powierzchni ziarna pyłku w odniesieniu do chorych uczulonych na pyłki roślin wiatropylnych (Śpiewak 1996). Produkty bakteryjne mogą wywoływać różnorodne reakcje, które mieszczą się w kategorii swoistej nadwrażliwości lub, w szerszym ujęciu, w grupie reakcji immunotoksycznych (Burrell 1993). Wydaje się prawdopodobne, że część objawów alergicznych wywoływanych ekspozycją na pyłki może być skutkiem obecności na ziarnach pyłku bakterii i ich produktów. Bardzo znamiennym przykładem może być uwalniana w wyniku rozpadu pałeczek Gram-ujemnych endotoksyna, substancja lipopolisacharydowa o znanym działaniu aktywującym makrofagi do produkcji interleukiny 1 (IL-1), czynnika nekrotycznego (TNF) i innych cytokin (Burrell 1993). Klinicznymi objawami takich reakcji mogą być między innymi zaburzenia ze strony układu oddechowego i odczyny skórne (Dutkiewicz 1989, Dutkiewicz i wsp. 1992, Dutkiewicz i wsp. 1994). We wcześniejszej publikacji (Śpiewak i wsp. 1996 a) wykazaliśmy obecność endotoksyny w próbkach pyłków żyta, bylicy, leszczyny, olchy i brzozy, podając jednocześnie przybliżoną kalkulację ekspozycji na entotoksynę związaną ze szczytowym pyleniem brzozy. Narażenie takie określiliśmy szacunkowo na 0,039 - 0,071 ng/m3, co stanowi wprawdzie ułamek procenta stężenia wywołującego zaburzenia ze strony układu oddechowego u ludzi, jednak z drugiej strony udowodniono wpływ mniejszych stężeń tej substancji na czynność układu immunologicznego (Michel i wsp. 1991). Z alergennych pyłków roślin wiatropylnych można ponadto wyhodować różnorodne grzyby mikroskopowe. Produkty grzybów, podobnie jak produkty bakteryjne, mogą wywoływać reakcje alergiczne oraz immunotoksyczne. Nie jest wykluczone, że obecność grzybów oraz ich produktów może odpowiadać za część objawów alergicznych wywoływanych ekspozycją na pyłki (Śpiewak i wsp. 1996 b). Znane jest na przykład silne działanie alergizujące spor grzybów z rodzaju Penicillium oraz Alternaria. Na podstawie przeprowadzonych badań trudno jednak określić, czy obecność spor bądź grzybni na ziarnie pyłku ma istotne znaczenie w rozwoju objawów chorobowych u osób z pyłkowicą.

Wnioski

Na pyłkach roślin wiatropylnych obecna jest mieszana mikroflora bakteryjna, obejmująca bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne oraz termofilne promieniowce, a także jest mieszana mikroflora grzybicza, obejmująca grzyby z rodzajów Alternaria, Penicillium, Cladosporium, Oidiodendron oraz drożdżaki. Określenie ewentualnej drogi skażenia pyłku przez mikroorganizmy, a także implikacji tego faktu wymagają dalszych, pogłębionych badań.

Przedstawione badania zostały sfinansowane w ramach działalności statutowej Instytutu Medycyny Wsi w Lublinie (temat 1.8/96 "Rola czynników mikrobiologicznych w patogenezie pyłkowicy"). Nieocenioną pomoc przy zbieraniu materiału do badań wyświadczyły autorom Pani mgr Katarzyna Dechnik z Wytwórni Surowic i Szczepionek "Biomed" w Krakowie oraz Pani dr Maryla Lankosz z Ogrodu Botanicznego UJ.

Piśmiennictwo

1. Burrell R., 1993. Human immune toxicity. Molec. Aspects. Med. 14: 1-81.
2. Colldahl H., Carlsson G., 1968. Allergens in pollen. Acta Allergol. 23: 387-395.
3. Colldahl H., Nilsson L., 1973. Possible relationship between some allergens (pollens, mites) and certain microorganisms (bacteria and fungi). Acta Allergol. 28: 283-295.
4. Cox C.S., Wathes C.M.(red.), 1995. Bioaerosols Handbook. CRC Press, Boca Raton.
5. Dutkiewicz J., 1989. Bacteria, fungi and endotoxin in stored timber logs and airborne sawdust in Poland. W: O'Rear C.E., Llewellyn G.C. (Red): Biodeterioration Research 2. Plenum Press, Nowy Jork.
6. Dutkiewicz J., Olenchock S.A., Sorenson W.G., Gerencser V.F., May J.J., Pratt D.S., Robinson V.A., 1992. Levels of bacteria, fungi and endotoxin in stored timber. Int. Biodeterioration 30: 29-46.
7. Dutkiewicz J., Pomorski Z.J.H., Sitkowska J., Krysińska-Traczyk E., Skórska C., Prażmo Z., Cholewa G., Wójtowicz H., 1994. Airborne microorganisms and endotoxin in animal houses. Grana 33: 85-90.
8. Gregory P.H., 1973. The Microbiology of the Atmosphere, wyd. 2. Leonard Hill, Londyn.
9. Michel O., Ginanni R., Le Bon B., Duchateau J., 1991. Effect of endotoxin contamination on the antigenic skin test response. Ann. Allergy 66: 39-42.
10. Obtułowicz K., Kotlinowska T., Stobiecki M., Dechnik K., Obtułowicz A., Manecki A., Marszałek M., Schejbal-Chwastek M., 1986. Environmental air pollution and pollen allergy. Ann. Agric. Environ. Med. 3: 131-138.
11. Schäppi G.F., Monn Ch., Wüthrich B., Wanner H.-U., (w druku). Analysis of allergens in ambient aerosols: Comparison of areas subjected to different levels of air pollution. Aerobiologia.
12. Śpiewak R., 1996. Rola mikroflory pyłku roślin wiatropylnych w etiopatogenezie astmy. Int. Rev. Allergol. Clin. Immunol. 2(supl. 2): 6.
13. Śpiewak R., Skórska C., Prażmo Z., Dutkiewicz J., 1996 a. Bacterial endotoxin associated with pollen as a potential factor aggravating pollinosis. Ann. Agric. Environ. Med. 3: 57-59.
14. Śpiewak R., Krysińska-Traczyk E., Sitkowska J., Dutkiewicz J., 1996 b. Microflora of allergenic pollens - a preliminary study. Ann. Agric. Environ. Med. 3: 127-130.

© Radoslaw Spiewak